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如何优化超速离心方法从血浆中获得更纯的外泌体

发布日期:2021-05-21 09:08:37   来源 : unknown    作者 :unknown    浏览量 :13
unknown unknown 发布日期:2021-05-21 09:08:37  
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​2015年7月,Nature在线发表了一篇名为“Glypican-1 identifies cancerexosomes and detects early pancreatic cancer”的研究性论文。由于胰腺的生理位置隐蔽,因此大规模的胰腺癌筛查很难实现,而该论文系统的阐述了通过在血液中检测含有Glypican-1蛋白(即GPC1)的外泌体用于诊断胰腺癌。自此,外泌体从小众研究圈破圈而出,走向了大众学者。同时也开启了延续至今的外泌体研究热潮。
 
如果关注外泌体领域久了,细心的研究者会发现一个问题,目前大量的外泌体研究都聚焦在外泌体携带的RNA上,外泌体携带的蛋白、脂质等研究则较为少见。其实,这更多是因为实验技术上的困难导致的。传统的策略通产难以去除与外泌体共分离的游离蛋白复合体等成分。深究一下,其实在很多外泌体RNA的相关研究也存在将共分离RNA作为外泌体RNA研究的案例。尤其是在血浆来源外泌体的相关研究中,这种情况较为常见。更多的细节可以关注2019年发表在Cell上的论文“Reassessment of ExosomeComposition”。该论文详细列举了目前存在争议的RNA分子及相关研究报道。
 
目前血浆来源外泌体的研究中,接受度最高的高纯度外泌体分离方法自然是超速离心联合密度梯度离心。该方法能够利用密度差异最大程度的排除掉血浆中含量丰富的脂蛋白颗粒及miRNA-蛋白复合体等污染物。但是该方法耗时长,并且铺设密度梯度是一个很繁琐的操作,因此实际应用中大家都选择尽可能规避这一方法,减少这一方法的使用。那么有没有纯度好且更为简易的方法呢。
 
今天推荐大家一篇论文:“Balancing yield, purity andpracticality: a modified differential ultracentrifugation protocol forefficient isolation of small extracellular vesicles from human serum”于2019年发表在RNA Biology上。相信读完之后就会获得新技能了。
 
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该论文中,作者们主要着手对比了超速离心及其优化策略对血浆外泌体分离纯度的影响。论文对比了三种策略:P1、两次超速离心获得外泌体沉淀; P2、三次超速离心获得外泌体沉淀; P3、第一次超速离心增加30%的重水蔗糖垫,离心后取出蔗糖垫,使用PBS稀释蔗糖垫,二次超速离心获得外泌体沉淀。
 
作者们使用三种策略分离纯化了相同个体来源血浆中的外泌体,并对提纯的外泌体进行了多方面的表征分析。统计数据显示,三种策略都可以分离到直径在100-150nm的颗粒,同时第1种策略(简单两次超速离心)会获得更多的颗粒(如下图)。因为潜在的脂蛋白颗粒及miRNA-蛋白复合物的影响,更多的颗粒可能只是表象。
 
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不同策略获得的外泌体大小和浓度
 
作者们对纯化的外泌体进行了免疫印迹分析。使用了ApoA-1、ApoB两个指标反映血浆中大量存在的脂蛋白在外泌体样品中的残留情况。miRNA-蛋白复合体是血液中存在的会影响外泌体miRNA分析的主要蛋白复合体,Ago2是miRNA的常见结合蛋白,在介导miRNA功能发挥中具有重要作用,因此作者们还是用了Ago2这个指标来反映不同策略纯化的外泌体中游离蛋白复合体及miRNA的残留情况。检测结果显示,只有使用第3种策略才可以较好的去除脂蛋白颗粒和RNA-蛋白复合体的残留(如下图)。
 
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不同策略获得的外泌体样品中脂蛋白颗粒和miRNA-蛋白复合体标志物的免疫印迹分析
 
综合两部分数据来看,虽然蔗糖垫的使用降低了“颗粒”的产量,但该方法对血浆中脂蛋白颗粒以及miRNA-蛋白复合体的去除效果具有明显的改善作用。而对于下游的组学分析来说,无论是RNA组学还是蛋白组学分析,脂蛋白和miRNA-蛋白复合体的污染对结果的影响都是致命的,这也是很多争议研究的关键所在。使用蔗糖垫的策略则可以较好的规避这两种常见血浆来源外泌体污染物的影响,最大程度的减少潜在的错误结论。
 
需要进行血浆来源外泌体相关研究的朋友可以关注一下蔗糖垫优化的超离策略,同时这也是2016年Thery等发表的外泌体研究protocol中曾经推荐过的策略。这一策略一定程度上兼具了超速离心方法的效率和密度梯度离心策略的高纯度。该方法中使用的重水在国内可以购买到,一般每百毫升的价格在千元以内。希望大家可以在未来的工作中获得更加准确可靠的研究成果。
 
参考文献:Balancingyield, purity and practicality: a modified differential ultracentrifugationprotocol for efficient isolation of small extracellular vesicles from humanserum
 
 

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